Uit groeiexperimenten blijkt dat de indicatorbacterie Aeromonas snel groeit op waterpissebedden uit het distributienetwerk en op de vetzuren en aminozuren die in hoge concentraties in deze waterpissebedden voorkomen. Sediment blijkt bij deze groei een belangrijke rol te spelen.
Download hier de pdf van dit artikel.
Het Nederlandse drinkwater wordt wereldwijd gezien als drinkwater van een zeer hoge microbiologische kwaliteit dat zonder rest-desinfectiemiddel gedistribueerd en geconsumeerd kan worden. Ondanks de zeer hoge kwaliteit kan nagroei van micro-organismen leiden tot volksgezondheidskundige (bijvoorbeeld Legionella pneumophila) en esthetische problemen (bijvoorbeeld geur/smaakproblemen en groei van waterpissebedden die het menselijk oog kunnen waarnemen). Vanwege de mogelijke nagroeiproblematiek zijn de bacteriën KG22 en Aeromonas in het Drinkwaterbesluit opgenomen als indicatororganismen voor nagroei en de biologische stabiliteit van het drinkwater. Deze parameters worden periodiek door drinkwaterbedrijven bepaald in drinkwatermonsters uit het distributiesysteem. Een Aeromonas-aantal in het distributiesysteem van maximaal 1.000 kolonievormende eenheden (kve) per 100 ml is daarbij de wettelijke norm waaraan de drinkwaterbedrijven moeten voldoen. In sommige distributiegebieden wordt deze norm echter, met name in de zomer, overschreden.
De betekenis van Aeromonas als nagroei-indicator staat ter discussie in de bedrijfstak. Er zijn namelijk geen directe verbanden gevonden tussen Aeromonas en aan nagroei gerelateerde gezondheidskundige of esthetische problemen (opportunistische pathogenen als L. pneumophila, geur/smaak, bruin water, ongewervelde dieren; [1]). Aeromonas-stammen uit het distributiesysteem groeien op stoffen afkomstig van biomassa (aminozuren en langketige vetzuren). Tevens is groei van Aeromonas in aanwezigheid van een waterpissebed waargenomen [2], maar het is onduidelijk hoe en in hoeverre de groei van Aeromonas en de aanwezigheid van waterpissebedden in het distributiesysteem zijn gekoppeld. Dit artikel beschrijft een onderzoek naar dit verband, waarbij met veldmetingen en laboratoriumanalyses de relatie tussen Aeromonas-groei en waterpissebedden verder is gekarakteriseerd. Het onderzoek is uitgevoerd door KWR Watercycle Research Institute in een samenwerkingsverband met de drinkwaterbedrijven Dunea, PWN, Waternet en Evides (DPWE).
Verzamelen en karakteriseren van waterpissebedden uit het distributiesysteem
Door middel van spuiacties zijn waterpissebedden verzameld uit drie distributiegebieden van Evides waar de Aeromonas-norm wordt overschreden. Het betreft twee locaties met oppervlaktewater als bron en één locatie met grondwater als bron. In het distributiegebied van de eerste twee locaties zijn standaard spuiacties uitgevoerd. In het derde distributiegebied is een spuiactie uitgevoerd met water dat verrijkt is met CO2, een spuimethode die in Duitsland wordt toegepast om waterpissebedden te verwijderen [3]. Circa twintig exemplaren zijn vervolgens in leven gehouden door ze te bewaren in het donker bij 15°C, in drinkwater met sediment en een esdoornblad.
Van een groot aantal andere waterpissebedden uit deze distributiegebieden is de lengte bepaald en is het aantal inwendig aanwezige Aeromonas-bacteriën geanalyseerd. De lengte van de waterpissebedden varieert tussen de 1,2 en 7,2 mm. De Aeromonas-aantallen variëren sterk per waterpissebed (< 5 – 1,5×109 kve per waterpissebed; afbeelding 1) en vertonen geen verband met de lengte. Aeromonas-aantallen in waterpissebedden, die direct na isolatie uit het distributiesysteem zijn geanalyseerd, varieerden van < 1 tot 1,1x108 kve per waterpissebed. Bij de waterpissebedden uit het distributiesysteem is geen systematisch verschil in Aeromonas-concentratie tussen dode en levende exemplaren gevonden. In de levende waterpissebedden, die gedurende zeven weken in leven zijn gehouden, zijn zeer hoge aantallen Aeromonas gevonden met een lage variatie tussen exemplaren. De Aeromonas-aantallen in het water van deze kweek waren hoog (5,8*104 kve/ml). Deze hoge Aeromonas-aantallen in combinatie met de observatie dat de waterpissebedden gedurende zeven weken niet afstierven, maken het aannemelijk dat Aeromonas niet schadelijk is voor waterpissebedden.
Afbeelding 1. Aeromonas-aantallen in waterpissebedden
Vetzuur- en aminozuurgehalte van waterpissebedden
Aeromonas-bacteriën die uit drinkwater zijn geïsoleerd hebben een hoge affiniteit voor aminozuren en vetzuren, met uitzondering van stearaat en lysine. Uit onderzoek van een aantal waterpissebedden, die dood of levend uit het drinkwater van één locatie in het distributiesysteem zijn verzameld, blijkt dat er verschillende concentraties vetzuren en aminozuren voorkomen. In de onderzochte dode waterpissebedden waren cis-vacceenzuur, oleaat, stearinezuur en arachidonzuur de vetzuren die in de hoogste concentraties zijn aangetroffen (1,49 - 3,32 μg vetzuur per mg droge stof). In levende individuen waren deze vetzuurconcentraties een factor 1,6 – 18,4 lager (0,08 – 2,02 µg vetzuur per mg droge stof). Wanneer alle gevonden vetzuren worden opgeteld bevat één dode waterpissebed, gebaseerd op een gemiddeld drooggewicht van 1,6 mg per individu, een gemiddelde vetzuurconcentratie van 24,3 ± 0,16 μg, terwijl een levende waterpissebed gemiddeld 5,9 ± 0,01 μg vetzuren bevat. De aminozuren arginine, lysine, glutamine en histidine zijn in de hoogste concentraties in levende individuen aangetroffen, terwijl de concentratie van deze aminozuren een factor 23,4 – 80,8 lager is in dode waterpissebedden. De gemiddelde aminozuurconcentratie (de som van alle gevonden aminozuren) in een levende waterpissebed is 21,3 μg, terwijl in een dode waterpissebed 0,9 ± 0,02 μg aminozuren is gevonden.
Dat dode waterpissebedden meer vrije vetzuren bevatten dan levende wordt waarschijnlijk veroorzaakt door de afbraak die in dode exemplaren gaande is, waarbij vetzuren vrijkomen. Deze vetzuren kunnen vervolgens als voedingsbron dienen voor Aeromonas en andere micro-organismen. Het lagere gehalte aminozuren in dode waterpissebedden wordt waarschijnlijk veroorzaakt doordat de aminozuren na afbraak vrijkomen en gemakkelijker of sneller oplossen in water. Vervolgens kunnen ze door Aeromonas en andere micro-organismen voor hun groei worden benut.
Groei van Aeromonas op waterpissebedden, vetzuren en aminozuren in drinkwater
Om de situatie van Aeromonas-toename in het distributiesysteem na te bootsen zijn verschillende groeiproeven uitgevoerd in het laboratorium. Bepaald is of en hoe goed Aeromonas kan groeien in drinkwater uit de kraan en spuiwater (drinkwater dat tijdens spuien is opgevangen en een veel hogere concentratie sediment bevat dan drinkwater uit de kraan), met daaraan afzonderlijk toegevoegd verschillende waterpissebedden (levend, dood) en mengsels van vetzuren en aminozuren (afbeelding 2). Aan alle groeiproeven is bij de start een lage dosis (<10 kve/ml) van vier uit drinkwater geïsoleerde Aeromonas-stammen gedoseerd. Alle groeiproeven zijn uitgevoerd in ongepasteuriseerd drinkwater. Hierdoor is de autochtone microbiële flora nog aanwezig in het water. Deze concurreert met Aeromonas om de beschikbare voedingsstoffen, net als in het echte drinkwaterdistributiesysteem.
In de proef waarbij de levende waterpissebedden zijn getest in spuiwater (afbeelding 2, links), was het initiële biomassagehalte relatief hoog (99 ng ATP/l), maar de groei van Aeromonas gering (tot maximaal 385 keer de norm van 1.000 kve/100 ml). In spuiwater met dode waterpissebedden (oranje in afbeelding 2) of een mengsel van aminozuren (lichtblauw in afbeelding 2) vermeerderde Aeromonas zich tot aantallen boven de 106 kve/100 ml. Dit is ongeveer duizend keer de wettelijke norm. In spuiwater met een levende waterpissebed die na twee dagen stierf (lichtgroen) en bij dosering van een vetzurenmengsel (paars) is groei van Aeromonas zichtbaar. De maximumaantallen waren onder deze condities echter wel een factor 73, respectievelijk 34, lager. Spuiwater met een levende waterpissebed die na vier dagen overleed liet echter geen duidelijke extra groeirespons zien. Waterpissebedden zorgen voor verhoogde groei van Aeromonas ten opzichte van de ‘blanco’ situatie waarin geen toevoegingen zijn gedoseerd. Dit wijst erop dat de bacterie groeit op stoffen die aanwezig zijn in de waterpissebedden. De groei op een vetzuur- en aminozuurmengsel, dat van nature aanwezig is in waterpissebedden, laat zien dat Aeromonas in staat is om deze stoffen om te zetten. Mogelijk zijn er nog andere stoffen aanwezig in waterpissebedden die Aeromonas kan afbreken, maar die geen onderdeel waren van deze studie.
Afbeelding 2. Groei van Aeromonas in spuiwater (links) en drinkwater (rechts) zonder toevoeging (blanco) of met verrijking van waterpissebedden of mengsels van aminozuren en vetzuren. Groeiproeven zijn in tweevoud uitgevoerd. Het gemiddelde met standaarddeviatie is gegeven. De ATP-concentratie, een maat voor de hoeveelheid aanwezige actieve biomassa, van het water op dag 0 is gegeven. Levend/dood: in deze groeiproef is de waterpissebed levend toegevoegd, maar overleden tijdens het experiment. Dit is met een pijl aangegeven in de grafiek
In het spuiwater zonder toevoegingen blijven de Aeromonas-aantallen gedurende de incubatieperiode van 14 dagen constant, terwijl in drinkwater zonder toevoegingen de concentratie binnen twee weken is afgenomen tot onder de detectiegrens (afbeelding 2). Uit deze resultaten valt te concluderen dat voedingsstoffen uit het sediment (waarvan een hogere concentratie aanwezig is in het spuiwater dan in drinkwater) door Aeromonas worden opgenomen, zodat de bacterie niet afsterft tijdens de incubatieperiode. Na 24 uur contact van een waterpissebed met het drinkwater (na 24 uur is de waterpissebed verwijderd) werd geen groei van Aeromonas waargenomen (afbeelding 2, onder), wat aantoont dat afgifte van groeibevorderende verbindingen door een waterpissebed aan het drinkwater niet zonder meer optreedt. De aan drinkwater gedoseerde levende waterpissebedden, afkomstig uit het distributiesysteem of de KWR-kweek, waren waarschijnlijk door voedselgebrek na 24 uur overleden. De dosering van waterpissebedden had in alle gevallen een toename van Aeromonas tot gevolg, waarbij voor de levende individuen een maximumwaarde van circa 2×104 kve/ml werd bereikt. Dit is vijf keer zo laag als het groeimaximum op dode waterpissebedden in de groeiproeven met spuiwater. De herkomst van de waterpissebedden had geen effect op de Aeromonas-toename in de groeiproeven. In drinkwater met het vetzurenmengsel werd geen toename van de Aeromonas-aantallen waargenomen. Aminozuren zorgen wel voor verhoging van het aantal in drinkwater, maar de respons is meer dan honderd keer lager dan in spuiwater. Aminozuren en vetzuren spelen in drinkwater waarschijnlijk wel een rol als deze samen voorkomen met een dode waterpissebed. Verhoogde groei van Aeromonas in spuiwater met en zonder waterpissebedden, en met aminozuren en vetzuren in vergelijking met drinkwater, tonen aan dat sediment in het spuiwater ook een rol speelt bij de toename van het aantal Aeromonas in het distributiesysteem. Deze laboratoriumobservaties komen overeen met praktijkwaarnemingen die een relatie van Aeromonas met sediment hebben laten zien.
Waterpissebedden als voedsel voor Aeromonas
De groeiproeven laten zien dat de Aeromonas-aantallen in 600 ml drinkwater met een levende of dode waterpissebed (gelijk aan 1.700 individuen per m3) in aanwezigheid van de autochtone microflora binnen twee dagen tot ruim (1.000 – 10.000 keer) boven de norm van 1.000 kve/100 ml kunnen toenemen. Deze twee dagen komen overeen met verblijftijden die ook in het distributiesysteem voorkomen. De aantallen waterpissebedden die in het Nederlandse drinkwater worden geteld variëren van <0,1 tot ongeveer 200 per m3 spuiwater [4]. In dit onderzoek werden vergelijkbare aantallen waterpissebedden in de onderzochte distributiesystemen gevonden. Het maximale aantal waterpissebedden in drinkwater is dus ongeveer tien keer lager dan het aantal waterpissebedden dat in de groeiproeven is gebruikt. De maximumaantallen in het distributiesysteem zijn echter voldoende om tot overschrijding van de norm voor Aeromonas te leiden. Aangezien het onderzoek is uitgevoerd onder gecontroleerde laboratoriumcondities (b.v. stilstaand water, constante temperatuur, etc.) kan de praktijk mogelijk verschillen. Hoewel de getoonde gegevens geen bewijs zijn voor de betrokkenheid van waterpissebedden bij de toename van Aeromonas in het distributiesysteem, lijkt het wel zeer aannemelijk. Op welke wijze deze associatie precies plaatsvindt en leidt tot een toename van het aantal kweekbare Aeromonassen in drinkwater, is onderwerp van vervolgonderzoek.
Conclusies
De resultaten van deze studie laten zien dat:
- levende en dode waterpissebedden uit het distributiesysteem zeer hoge Aeromonas-aantallen kunnen bevatten
- bij het in kweek houden van waterpissebedden in een laboratoriumsituatie de Aeromonas-aantallen in het water en de waterpissebed zeer hoog zijn
- toevoegen van een waterpissebed (dood of levend) aan drinkwater of spuiwater onder laboratoriumcondities zorgt voor een sterke toename van Aeromonas, ook in de aanwezigheid van de autochtone bacteriepopulatie.
Uit deze resultaten kan worden geconcludeerd dat waterpissebedden in het distributiesysteem een oorzaak kunnen zijn voor groei van Aeromonas. Hoe belangrijk deze rol van waterpissebedden is ten opzichte van andere factoren die mogelijk groei van Aeromonas veroorzaken, dient verder onderzocht te worden.
Het DPWE-programma is het collectieve onderzoeksprogramma van de vier duinwaterbedrijven Dunea, PWN, Waternet en Evides. Het onderzoek wordt uitgevoerd door KWR.
Referenties
- Wielen, P.W.J.J. van der (2015). Waarde KG22 en Aeromonas als wettelijke parameters nagroei. Concept BTO rapport, KWR Watercycle Research Institute, Nieuwegein, NL.
- Hijnen, W.A.M., Reijnen, G.K., Bos, R.H.M., Veenendaal, G. & Kooij D. van der (1992). Lagere Aeromonas-aantallen in het drinkwater van pompstation Zuidwolde door verbeterde ontgassing èn vernieuwen van het filtergrind. H2O, vol. 25, nr. 14, 370 - 375.
- Gunkel, G., Scheideler, M. en Michels, U. (2015) Invertebrates in drinking water distribution systems. GWF-Wasser/Abwasser International issue (1), 52 - 55.
- Lieverloo, J.H.M. van, Hoogenboezem, W., Veenendaal, G. en Kooij, D. van der (2012) Variability of invertebrate abundance in drinking water distribution systems in the Netherlands in relation to biostability and sediment volumes. Water Res. 46, 4918 - 4932.
